Jak používat GSH úrovně při detekci ROS

glutathionu GSH, nebo je neesenciální Tripeptid z cysteinu, glutamátu a glycinu. Je to silný antioxidant, který chrání buňky a orgány těla před škodlivými účinky ROS nebo reaktivních kyslíkových radikálů, které vznikají z molekulárního kyslíku v důsledku různých metabolických procesů v těle. Antioxidanty, jako je glutathion, neutralizuje volné kyslíkové radikály zneškodnit a zabránit jim v interakci s a poškození DNA a bílkoviny v buňkách. Poměr oxidované a redukované formy GSH v těle svědčí o ROS související oxidačního stresu ve vašem těle. Věci, které budete potřebovat
stříkačky
motýl jehly
centrifugy
heparin sodný
Mrazák
kyselinou sulfosalycilovou
GSH reakce Agent
Microplate
Světelný zdroj
GSH standardní roztok
Zobrazit další instrukce
1

Nakreslete přibližně 2 ml krve ze žíly na anticubetal žíly s 23-gauge butterfly jehlou do 5 ml injekční stříkačky. Přidat vzorku do zkumavek obsahujících heparin sodný a jemně převraťte zkumavku míchání.
2

Sbírejte červené krvinky odstředěním vzorku při 2500 otáčkách za minutu po dobu pěti minut. Zmrazit a rozmrazit vzorek třikrát rozbít buňky. Odstřeďuje buněčného lyzátu roztoku po dobu 10 minut při 12000 otáčkách za minutu a 4 stupně, a sbírat supernatant.
3

Vyjměte proteinu ze vzorku přidáním 5 procent sulfosalicylovou kyseliny a odstředění vzorek při 12000 rpm po dobu pěti minut při teplotě 4 °. Skladujte deproteinované supernatant -112 stupňů.
4

Mix thiolové detekční činidlo, GSH reduktázy, nikotinamidadenindinukleotidfosfát a tlumivého roztoku v poměru uvedených výrobcem sestavy, aby GSH reakční směsi. Výše každou chemickou látku závisí na počtu testů, které má v úmyslu provést. Se zředí GSH reakční směsi 5 procent kyselinou sulfosalycilovou získat koncentraci 16, 32, 63, 125, 250 a 500 ul.
5

Přidat 1-10 mikrolitrů deproteinované krevního vzorku do jamek na mikrotitrační destičky. Přidat ředěny GSH standardní řešení, které je k dispozici v testovací sadě, do každé jamky, aby celkový objem každé jamky 10 mikrolitrů.
6

Přidat 90 ul GSH reakční směsi, které jste provedli v kroku 4 se do každé jamky v mikrotitrační destičky. Smíchejte činidlo třepáním destičku po dobu 30 sekund.
7

Změřte absorbanci okamžitě tím, že se deska pod světlem s vlnovou délkou 405 a 415 nanometrů. Inkubujte destičku po dobu 30 minut. Vezměte absorbance po každých pět minut během inkubace.
Fotografie 8

zředí 6 milimolární zpracovaného vzorku s 5 procent kyselinou sulfosalycilovou a trifluromethane sulfonátového řešení. Tím se odstraní veškeré snížení GSH z roztoku. Přidat 1-10 micoliters tohoto řešení do jamek mikrotitračních a opakujte kroky 5, 6 a 7. To vám pomůže odhadnout množství oxidovaného GSH ve vzorku.
9

Plot absorbance a koncentrace vzorku na grafu, aby získal GSH křivky jak snížit a oxiduje glutathionu. Vypočítá se poměr mezi oběma formami GSH. Zvýšené hladiny GSH oxidační hodnoty jsou oxidační stres a ROS.