Jak k testování nukleových kyselin

Testování nukleových kyselin se provádí v lékařské diagnostice, aby bylo možné zjistit, patogeny, jako jsou viry nebo bakterie. Tyto testy jsou mnohem rychlejší, a proto, aby lékař začít léčbu pacienta, který normálně by musel čekat na potvrzení infekce pomocí více zdlouhavé a pracné na bázi protilátky testy. Tento proces je také znám jako nukleové kyseliny testu amplifikace, a zahrnuje metodu známou jako "reverzní transkriptázy zesílení" pomocí polymerázové řetězové reakce. Protože se jedná o vysoce specializovaný vědecký postup, pokročilé znalosti a odborné znalosti v oblasti techniky molekulární biologie a teorie je potřeba. To, co budete potřebovat
PCR zkumavek
PCR termocykleru
pipety a filtru tipy
rukavice
buňky
Trizol nebo jiné extrakci RNA PCR činidla
vyrovnávací
Taq polymerázu
RT-PCR na 1 mg /ml koncentrace
RNase-Free Water
dNTP
MgCl2
Náhodné nátěry na 1,8 mg /ml, koncentrace
SuperScript II reverzní transkriptázy

Zobrazit další instrukce
zpracování a příprava RNA
buněk
1

úrodu s činidlem extrakce RNA, jako Trizol. 1 ml, je dostatečné pro sběr buněk z jedné i z šesti-jamkové destičky pro tkáňové kultury. Buňky se důkladně odpipetuje nahoru a dolů, a poté homogenizuje provést extrakční postup, jak je popsáno v manuálu Trizol. Stručně řečeno, extrahovat chloroformem a poté se odstředí oddělit fáze DNA, bílkoviny a RNA. Obnovit pouze bezbarvý RNA fáze a precipitát, který se pomocí isopropanolu. Po inkubaci odstředivek, které a čistit výsledný pelety s několika etanolu myje. Pak resuspendujte peletu v RNase bez vody.
2

reverzní transkripci, denaturační přesně 5 mikrogramů RNA 65 stupňů Celsia na 10 microliter (ul) objem RNázy volné vody, pak rychle místo na ledě. Pro každou reakci, kombinovat 10 ul RNA, 3 ul 10X PCR reakčního pufru, 2,5 ul 10 milimolární dNTP, 6l 25 milimolární chloridu hořečnatého, 1 ul náhodných primerů z 1,8 mg na mililitr koncentraci, a 0,5 ul horní index II reverzní transkriptázy enzym. Doplňte každou reakci s 17 ul RNase bez vody. Inkubujte při pokojové teplotě po dobu deseti minut a pak se při 42 stupních Celsia po dobu jedné hodiny k vytvoření cDNA, pak denaturuje při 95 ° C a rychle se led k zastavení reakce.
3

pro polymerázovou řetězovou reakcí, znovu nastavit reakční směsi v 0,5 ml zkumavkách kombinací 6 ul cDNA bylo dosaženo v reakce reverzní transkripce, 1,5 ul 10X PCR reakčního pufru, 0,2 mikrolitrů Taq polymerázy, 0,5 mikrolitrů reverzní primer a také dopředného primeru, dolijte každé zkumavky s 10,3 ul RNase bez vody. Chcete-li spustit reakce, nastavit termocykleru (tj. stroj, který vykonává polymerázová řetězová reakce) po dobu 30 cyklů takto: 95 stupňů Celsia po dobu 0,5 minuty na denaturační, následuje 60 stupňů Celsia po dobu 45 sekund napojil a konečně 72 stupňů C po dobu 1 minuty rozšiřují syntetizován přepis.