Jak si vyrobit protilátka ředění pro IHC

imunohistochemie (IHC) je specializovaná technika, kterou vědci představit buněk ve tkáních, které byly uvedeny na sklíčko a obarví vhodným protilátkou, která rozpoznává protein, který je jedinečný na buňku nebo tkáně v šetření. Protilátek ředění (titrace), musí být prováděna za použití experimentálních podmínek uvedených v návodu k vlastní protokol, a to, že protilátky výrobcem, protože dva nemusí být totožné. Věci, které budete potřebovat
buňky na skvrnu
protilátek
ředicím pufrem ("ředidlo")
Pipety a špičky
mikrozkumavky
Hliníková fólie
laboratorní markery, trubky a štítky internetu Lední
světlo chráněné slide box
Zobrazit další instrukce
1

kontrolu a přípravu protilátky. Zkontrolujte, zda je protilátka byla zvýšena ve správné hostitele, a reaguje s aktuální verze proteinu (známý jako isoformy nebo varianta sestřihu), který je testován. Pomocí pipety, pečlivě se 10 microliter část toto a označení jako "osobní doručení".

Pokud jen velmi malé objemy protilátky jsou k dispozici, tento krok přeskočte.

Vedení osobní zásoby protilátky je rutinní praxí ve všech laboratořích, které zabraňuje křížové kontaminaci původního genofondu. Rozdělte to na světlo chráněné mikrozkumavky, nebo normální mikrozkumavky, která je zabalená v alobalu chránit před přímým světlem.

Uchovávejte trubice na ledu, nejlépe v Esky se vzduchotěsným víkem, znovu, aby se minimalizovalo světlo, které může zničit protilátky. Poznamenejte původního genofondu je koncentrací (např. 100 jednotek v mililitru, 1 miligram na microliter a tak dále) na trubici, včetně názvu protilátky a jaké, pokud vůbec, zmírnily se ředí (např. sérum, fyziologický roztok, nebo vody atd.).
2

Připravte Ředicí pufr, také známý jako protilátky ředidla. Zkontrolujte, zda je to v souladu s protilátkou a imunohistochemie postup se používá, například, by se nezakrývají žádnou fluorescenci nebo bránit jakékoli následné sekundární protilátky označování. Proveďte standardní ředění imunohistochemie (také blokujícího pufru) smícháním 1X fosfátovým pufrem s 1% Triton-X100, 10% fetálního telecího séra a 0,2% azid sodný.
3

titrovat protilátka. S danou koncentraci protilátky v osobním skladem (vyjádřené jako koncentrace jednotky jako mikrogramů na microliter), stanovení objemu protilátky potřebné k dosažení 10 mikrogramů protilátky.

Nastavit sérii ředění pomocí pipety o objemu odpovídá 2 mikrogramů protilátek (např. X ul), v 100 mikrolitry rozpouštědla a důkladně promíchejte pipetováním nahoru a dolů. Od tohoto ředění se stejnými X mikrolitrů a dodává, že k následnému 100 mikrolitry ředidla. Tento postup opakujte, dokud 8-10 ředění (nebo seriál) je tvořen.

Poslední trubka bude mít tedy nejnižší koncentraci a být "nasycení" koncentrace, které bude generovat nejvyšší úroveň signálu v průběhu experimentu . Nicméně, bude ideální koncentrace o něco více, než je tato koncentrovaná, takže se vyrábí příliš mnoho signálu, což může způsobit chyby pozadí.

Label trubky správně s novými zředěných koncentracích.